Um biomédico, em seu projeto de pesquisa, obteve o clone de um gene de interesse. A
próxima meta é entender a função do gene para o organismo. Para isso, entre as
metodologias que deverão ser empregadas, haverá o sequenciamento do DNA. Assim, o
biomédico decide utilizar a técnica de sequenciamento de Sanger ou sequenciamento
didesóxi por ser a mais conhecida. A seguir estão descritas, de forma aleatória, as
etapas do sequenciamento de Sanger.
1
Começará a síntese do filamento de DNA complementar pela polimerase, iniciando
a partir do primer marcado.
2
Enfileira-se os diversos fragmentos sintetizados, todos com o mesmo ponto de
início e diferentes pontos de parada, do menor para o maior, com o
didesoxinucleotídeo no final de cada fragmento.
3 Desnaturam-se os dois filamentos do DNA alvo.
4
A ação da polimerase é interrompida em qualquer ponto no qual o
didesoxinucleotídio trifosfato for incorporado na cadeia de DNA em crescimento,
no lugar do desoxinucleotídio trifosfato normal.
5
Cria-se um primer marcado radioativamente para a síntese de DNA que
hibridizará, exatamente, em um local no segmento de DNA clonado.
6
Sabendo onde é o início da síntese do DNA e qual didesoxinucleotídeo finaliza
cada fragmento de diferentes comprimentos, tem-se o sequenciamento total do
DNA alvo.
7
Adiciona-se um “coquetel” especial de DNA polimerase, desoxinucleotídios
trifosfato normais (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), uma pequena quantidade de um
didesoxinucleotídio das quatro bases (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) e os
primers.
Para realizar a técnica de sequenciamento corretamente, o biomédico deverá seguir a
seguinte ordem de etapas: